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高效液相色譜法測定荜茇止痛酊中胡椒堿

文章出處:huifen 人氣: 发表时间:2019-05-31 09:13

  胡椒堿是一種廣譜抗驚厥藥,對小鼠實驗性電驚厥有良好的對抗作用,對戊四氮、印防己毒素、士的甯,以及腦室內注射筒箭毒堿、谷氨酸等引起的驚厥發作和聽源性發作,都有不同程度的對抗作用。

  目的建立荜茇止痛酊中胡椒堿的含量測定方法。方法采用高效液相色譜法,C18色譜柱,四氫呋喃-甲醇-水(V∶V∶V=30∶30∶50)爲流動相,流速爲1.0mL/min,柱溫爲室溫,檢測波長爲343nm,進樣10μL,以外標法計算含量。結果胡椒堿在8.3~41.5mg/L內峰面積與對照品的質量濃度呈良好線性關系,其回歸方程爲:A=3413186ρ-

  7467.7,r=0.9998;其平均回收率爲99.7%,RSD=1.8%(n=6)。結論該方法簡便,重複性好,空白無幹擾,可有效地控制荜茇止痛酊制劑的質量。

   荜茇止痛酊由荜茇、細辛和花椒等6味中藥組成,具有祛風散寒止痛的功效,臨床用于治療風寒牙痛。本制劑生産采用提取揮發油,水煮醇沈等工藝加工制成。荜茇爲方中君藥,其主要有效成分爲胡椒堿,2005版《中華人民共和國藥典》(一部)采用內標法測定荜茇中胡椒堿的含量[1],文獻報道胡椒堿的含量測定方法有高效液相色譜法[2-4]。本試驗采用改進四氫呋喃-甲醇-水系統爲流動相,外標法測定胡椒堿的含量,較適用于本中藥複方制劑複雜成分的分離,有效控制荜茇止痛酊的質量。

  1儀器與試藥

  高效液相色譜儀(日本島津)LC-6A,包括:SPD-6AV檢測器,C-R4A數據處理機。胡椒堿(批號0775-9702,由中國藥品生物制品檢定所提供,純度爲98.79%);荜茇止痛酊(批號041212、041216、041220,無錫山禾藥業股份有限公司生産)。甲醇、乙腈爲色譜醇,無水乙醇爲分析醇,水爲熏蒸水。

  2方法與結果

  2.1色譜條件

  色譜柱:C18柱(4.6mm×250mm,10μm),大連依科特科學儀器有限公司;流動相:四氫呋喃-甲醇-水(V∶V∶V=30∶30∶50);流速:1.0mL/min;檢測波長:343nm;柱溫:室溫;分離度:R>1.5;理論板數按胡椒堿峰計算應大于1500。

  2.2檢測波長的選擇

  對胡椒堿的乙醇溶液進行紫外區掃描,結果胡椒堿在343nm處有Z大吸收,故選用343nm作爲檢測波長。

  2.3流動相的選擇

  曾試驗4種流動相:①甲醇-水(77∶23);②乙腈-水(70∶30);③乙腈-0.05mol/L磷酸二氫鈉溶液(70∶30),用磷酸調節pH爲3.5、3.1;④四氫呋喃-甲醇-水(30∶30∶50),其中④使胡椒堿峰與雜質峰分離效果好,能基線分離。

  2.4溶液的制備

  對照品溶液的制備:精密稱取胡椒堿對照品10mg,置50mL棕色量瓶中,加乙醇稀釋至刻度,搖勻。精密量取5mL,置50mL棕色量瓶中,加乙醇稀釋至刻度,搖勻,即得(每1mL中含胡椒堿20μg)。

  供試品溶液的制備:精密量取荜茇止痛酊1mL,置25mL棕色量瓶中,加無水乙醇稀釋至刻度,搖勻,于冰箱中冷藏1.5h,取出,放置至室溫,濾過,取續濾液5mL,置25mL棕色量瓶中,加乙醇稀釋至刻度,搖勻,即得。

  陰性對照液的制備:按處方中藥味的比例自配不含荜茇的群藥,按其工藝制成陰性制劑,再按供試品溶液制備方法制成空白溶液,即得。

  2.5陰性液幹擾試驗

  精密吸取供試品溶液、陰性液和對照品溶液各10μL注入色譜儀中,由色譜圖可知,在與對照品色譜峰保留時間相應的位置上,供試品溶液具有相同保留時間的色譜峰出現;而陰性液在此峰位無吸收,對本品中胡椒堿的含量測定無幹擾,色譜圖見圖1。

  2.6線性關系的考察

  精密吸取胡椒堿對照品(10.38mg→50mL)1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL,分別置25mL棕色量瓶中,加乙醇稀釋至刻度,搖勻,分別精密吸取10μL,注入高效液相色譜儀,記錄峰面積。以對照品的含量對峰面積值作圖,得到一個通過原點的直線,並繪制標准曲線。結果表明,胡椒堿在8.3~41.5mg/L範圍內峰面積與對照品的質量濃度呈良好線性關系,其回歸方程爲:A=3413186ρ-7467.7,r=0.9998。

  2.7精密度試驗

  精密吸取同一供試品溶液(批號041212),重複進樣5次,求得RSD=0.93%。

  2.8穩定性試驗

  精密吸取同一供試品溶液(批號041212),分別于配制後0、2、4、8、16、24h測定色譜峰面積,計算RSD爲1.2%,結果表明,其在24h內基本穩定。

  2.9回收率試驗

  精密吸取已知含量的同一批號(批號041212)樣品0.5mL,分別精密加入胡椒堿對照品乙醇溶液,依法測定,結果平均回收率爲99.97%,RSD=1.8%(n=6)。見表1。表1加樣回收率試驗結果(略)

  2.10樣品中胡椒堿含量測定

  取3批荜茇止痛酊樣品,照“2.4”項測定,結果見表2。表2樣品含量測定結果(略)

  3討論

  本實驗采用高效液相色譜法內標法和外標法2種方法進行荜茇藥材中胡椒堿含量的對比試驗,結果顯示,2種方法測定結果基本相同。2005年版《中華人民共和國藥典》采用內標法測定含量,結果准確,但鑒于中藥複方制劑成分複雜,采用內標法時分離度難以滿足要求,因此,本實驗研究采用外標法更爲實際、可行。

  由于荜茇止痛酊所含成分複雜,給含量測定帶來一定的困難。我們在樣品前處理采用無水乙醇稀釋、冰箱中靜置除去雜質的方法,使樣品得到淨化,可滿足含量測定的要求,且重現性好。